擴增子是發生PCR反應的靶標基因片段。由于qPCR只是用于表征靶標基因的數量，并不需要得到其全長序列，因此擴增子區段的選擇具有相當的靈活性，在基因讀碼框的內部即可（mRNA的分析除外）。區段的選擇一般遵循以下原則：擴增子長度一般在75～200bp范圍。如果太長，擴增效率會降低；而太短又無法與引物二聚體區分開。盡可能避免產生二級結構區域。這會極大的影響擴增效率。目前很多網站都可以在線預測二級結構，操作簡單。盡可能避免了單堿基連續重復超過4次（如AAAA、CCCC等）。但有時在擴真核生物基因組時難以保證。GC含量盡可能在50%～60%。這一點在擴增某些物種（如放線菌）基因組時同樣難以保證。高GC模板擴增需要加入一些特殊成分來優化實驗，目前也有商品化的試劑。qPCR多種項目供您選擇。河北TaqMan熒光探針qPCR公司哪里有

Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標？qPCR試劑的評價需要從分析敏感性（比較低檢測限），分析特異性的（交叉反應），重復性（精密度），診斷敏感性，診斷特異性等多個指標去衡量（診斷試劑評價系列2-核酸檢測方法（更正），診斷試劑評價系列4-比較低檢測限，你做對了嗎？）。只憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優劣太片面，不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進行幾個循環的預擴增，再進行正式循環的做法就是為了使Ct值看起來更低。山西TaqMan探針法qPCR機構哪里有一個 qPCR 試劑盒的重心是引物探針設計、酶、反應體系和較好的反應條件。

什么是CT值比較法？數據怎么處理？CT值與起始DNA濃度的對數成反比：如果：不同管之間的PCR反應效率相同。這些PCR的反應效率接近100%。可以從上面的公式推出相對含量（X01/X02）=2-ΔCT。假設實驗的目標是研究藥物處理后0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用內對照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的測定結果都是CT值，而沒有通過標準曲線測定總RNA的pg數。內標法和外標法哪種數據更精密？是同樣可靠的。內標的優點在于目標基因與管家基因的反應條件較接近一致，缺點在于目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制，導致它們的PCR效率有差異。外標的優點在于目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它們的PCR效率有差異。兩相比較，內標法與外標法的數據精確度是一樣的。

與Ct值有關的參數：標準曲線Standardcurve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標表示起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。相關系數Correlationcoefficient(R^2)：反映了標準曲線的線性，通常要求>0.99。擴增效率Efficiency(E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。斜率 Slope ：當擴增效率為 100% 時斜率為 - 3.32，當 90%-110% 時的斜率為 - 3.58 ~ -3.10。qPCR的好處有些什么？

完整的探針包括熒光基團、淬滅基團和寡核苷酸序列三部分，理想的探針應該具有特異性高、熒光本底低等特點。對于寡核苷酸序列的設計一般遵循以下原則：GC含量30%～80%，C堿基要多于G堿基，長度一般15～30bp。過長會影響淬滅效率，導致熒光本底較高；過短則導致特異性下降。Tm值一般比引物的要高5～10℃。5’端不能安置G堿基。G堿基本身具有熒光淬滅的特性，會導致熒光基團被切掉后也無法發出熒光。熒光基團根據檢測的多重性靈活選擇，一般優先常規的 FAM 和 HEX，同時針對不同的熒光基團選擇合適的淬滅基團。SYBRGreen法qPCR實驗就找上海融享生物科技有限公司。湖南相對定量qPCR機構

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Ct值能否直接換算成模板拷貝數？通過制作標準曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數，前提是需要樣品與標準品同時擴增，定量標準品需要使用標準物質等定量準確的物質（OD260/280換算的的拷貝數誤差很大），即使如此定值結果仍存在一定的誤差。熒光定量PCR是否為定量方法？雖然名字里有「定量」，但是qPCR的間接定量方式又復雜，又受很多因素影響，又不準確，在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數字PCR是真正的定量檢測方法，其余的都是定性檢測方法。河北TaqMan熒光探針qPCR公司哪里有