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來源: 發布時間:2022-02-16

COIP實驗步驟
第三步:免疫共沉淀
根據不同的抗體結合方式,這里的免疫共沉淀步驟會稍有不同,但是本質是一樣的,都是為了形成抗原-蛋白復合物。
如果直接使用 Protein A/G 結合的 beads,先進行細胞裂解液/蛋白混合物與抗體的孵育,再加入 beads 將蛋白-抗體復合物拉下來。
如果使用了交聯劑將抗體與 Protein A/G 固定,或者直接將抗體固定在 beads,則將固定抗體的 beads 與細胞裂解液或則蛋白混合物一起孵育。
增加在洗脫之前的洗滌次數或在免疫共沉淀緩沖液中加入 Triton X-100 ,可以降低非特異性結合,以防止蛋白在陰性對照樹脂實驗樣品中被檢測到。
第四步:洗脫與檢測
***一步則是使用洗脫緩沖液將互作蛋白復合物洗脫,并通過 Western Blot 或者 Mass spectra 檢測鑒定蛋白。當蛋白或抗體對低 pH 的緩沖液敏感,可使用中性 pH 值的洗脫緩沖液。
注意事項:
如后續需進行酶活或功能性分析,則需使用兼容下游檢測的 Elution buffer 進行洗脫。
對于交聯劑結合的 beads,為了保持抗體偶聯樹脂的活性,應立即再生和存儲樹脂,保證抗體可以重復利用。
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免疫共沉淀(COIP)實驗過程
(1)轉染后24-48 h 可收獲細胞,加入適量細胞裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑),冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C, 最大轉速離心30 min后取上清;
(2)取少量裂解液以備Western blot分析,剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液,4°C緩慢搖晃孵育過夜;
(3)取10μl protein A 瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3 次,每次3,000 rpm離心3 min;
(4)將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h,使抗體與protein A瓊脂糖珠耦聯;
(5)免疫沉淀反應后,在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min,將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去,瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3-4次;***加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液,沸水煮5分鐘;
(6)SDS-PAGE, Western blotting或質譜儀分析。
注意的問題:
(1)細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktailer。
(2)使用明確的抗體,可以將幾種抗體共同使用。
(3)使用對照抗體:

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免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合,在外加磁場中,通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中,無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性,不在磁場中停留,從而使細胞得以分離。免疫磁珠應用分為正選法和負選法:正選法-磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞負選法-磁珠結合不需要的細胞,游離于上清液的細胞為所需細胞,一般而言,負選法比正選法的磁珠用量大磁珠:大小在0.1-0.45mm包被了生產的高質量單抗磁珠已為白細胞亞群的分選所優化將包被了特異性單抗的BDIMag磁珠加入細胞懸液,磁珠特異性地與有相應抗原的細胞亞群結合,通過分離得到的連有磁珠的細胞可直接用于功能試驗和用流式細胞儀檢測。

免疫磁珠(Immunomagneticbeads,IMB),是由載體微球和免疫配基結合而成的一種納米級材料.免疫磁珠分離技術是以高均一性的磁性微球為固相支持物,將免疫配基(如抗體,抗原等)通過功能基團結合到磁性載體上形成免疫磁性微球,利用特異性的免疫學反應,在磁力作用下,發生力學移動,從混合溶液中分離出特異性的靶物質.具有分離速度快,效率高,可重復性好,操作簡單,不需要昂貴的儀器設備等優點.本實驗采用化學共沉淀的方法合成了納米級Fe3O4磁性微粒,具有顆粒均一程度高,懸浮穩定性好,超順磁性等特點,經固體物含量的測定及其粒徑的測定,磁珠的濃度約為7.9mg/mL,粒徑約為30~100nm左右,對其懸浮液加入烷基化試劑和醛基化試劑進行表面修飾,提高了磁性微粒的性能.BEENbio Anti Myc Co-IP&CHIP磁珠 蛋白相互作用。

一種免疫磁珠及制作方法和用于檢測的方法及測試板,所述的免疫磁珠至少由磁性載體微球組成,該磁性載體微球結合有至少一種免疫配基;所述的磁性載體微球由磁性納米粒和高分子骨架材料組成,其**為金屬小顆粒,**外為高分子材料,**外層為帶有各種可以結合不同免疫配基功能基因的功能層;免疫磁珠的制作方法包括:磁珠預處理;活化磁珠;偶聯抗體的制作;對偶聯抗體用封閉液封閉;免疫磁珠純化等;用于檢測的方法是:利用免疫學反應夾心法,競爭法以及間接法檢測不同物質的存在,并在測試板上設置對照體系:測試板由包被試紙條,偶聯墊,樣品墊,吸水墊,覆蓋膜以及測試板外卡組成,它具有靈敏度高,定量準確,不受光學因素干擾,磁信號穩定,不易衰減,試劑簡單,穩定,低廉,檢測快速,適合現場檢測等特點.應用免疫磁珠分離法純化弓形蟲速殖子的研究。遼寧COIP免疫磁珠銷售

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免疫共沉淀(COIP)優點

(1)相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;

(2)蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;

(3)可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。

免疫共沉淀(COIP)缺點

(1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;

(2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用;

(3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇***檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

(4)靈敏度沒有親和色譜高。 黑龍江anti-Flag COIP免疫磁珠供應商

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