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廣州細胞支原體檢測方法等溫擴增

來源： 發(fā)布時間：2024-06-30

細胞培養(yǎng)中建議使用支原體檢測的原因主要有以下幾點：
1. 支原體污染率高：常規(guī)細胞培養(yǎng)中支原體污染率保守估計在15-35%之間。
2. 影響實驗結果：支原體污染會嚴重干擾實驗結果的可信度，影響培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生理特征。
3. 難以用光學顯微鏡檢測：支原體是極小的細菌，其細胞膜周圍沒有細胞壁，無法用光學顯微鏡檢測到。
4. 難以消滅：支原體能夠迅速滲透整個實驗室，一旦污染很難徹底消滅。
5. 影響產品質量：支原體污染會影響細胞培養(yǎng)產物的質量，監(jiān)管機構推薦檢測所有細胞培養(yǎng)產物中是否存在支原體。
6. 保證實驗準確性：定期進行支原體檢測和去除，確保無支原體存在細胞培養(yǎng)體系內，才能獲得準確的實驗結果。
科研中常見的支原體檢測方法？廣州細胞支原體檢測方法等溫擴增

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支原體去除試劑在清*支原體的過程中可能會對細胞的生長狀態(tài)產生一定的影響。支原體去除試劑是一種非抗*素類試劑，它通過與支原體膜特異性結合，改變支原體膜的通透性，從而導致支原體破裂死亡。盡管該產品在作用期間可能會對細胞的活力和形態(tài)有一定的影響，但由于它不能穿過真核細胞的細胞膜，因此不會改變細胞的任何特性。支原體被清*后，細胞在后續(xù)的傳代過程中能快速恢復其正常的生長和增殖狀態(tài)，細胞后續(xù)的生長增殖幾乎無影響。
此外，該產品不含抗*素，不會使支原體發(fā)生耐藥反應，細胞毒性小。然而，需要注意的是，不同細胞對支原體去除試劑的耐受程度有所差異，可以根據實驗結果適當調整細胞量和處理條件。在某些情況下，如果出現細胞變形、生長緩慢等現象，可以更換成標準培養(yǎng)液終止作用，或者調整去除試劑的使用濃度和作用時間。
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根據提供的信息，支原體去除試劑是一種混合制劑，通過抑制DNA和支原體生長所必須的相關蛋白合成來取得良好的支原體清*效果，同時對細胞無傷害。它被設計為對細胞毒性小，不影響后續(xù)的細胞實驗，包括細胞活力檢測和細胞轉染等。這表明使用支原體去除試劑去除支原體后，理論上不應該對細胞的轉染效率產生負面影響。
此外，支原體污染本身會對細胞的轉染效率產生負面影響。研究表明，與未污染的細胞相比，支原體污染的細胞轉染后具有較低的基因表達水平。因此，去除支原體后，可以預期細胞的轉染效率會得到改善，因為移除了影響細胞正常功能的污染物。

在科研中，支原體檢測是確保細胞培養(yǎng)純凈性的重要環(huán)節(jié)。以下是一些在科研中常見的支原體檢測方法：
1. 支原體培養(yǎng)法：這是一種傳統(tǒng)的檢測方法，通過將細胞培養(yǎng)物接種到特定的培養(yǎng)基中，觀察是否有支原體生長。這是直接的檢測方法，但耗時較長，通常需要數周時間。
2. DNA染色法：使用熒光染料（如Hoechst或DAPI）染色細胞核，然后通過熒光顯微鏡觀察。這種方法操作簡便，可以快速得到結果，但特異性不高，可能會有假陽性。
3. 聚合酶鏈反應（PCR）法：這是一種分子生物學技術，通過設計特異性的引物，擴增支原體DNA，從而檢測支原體的存在。PCR法具有高靈敏度和特異性，已成為日常細胞培養(yǎng)維護的可靠方法。
4. 核酸擴增技術（NAT）：NAT技術通過擴增并檢測特定的支原體基因組保守序列來進行支原體污染檢測，具有快速、簡便的特點。
細胞培養(yǎng)為什么建議使用支原體檢測？

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qPCR法，即定量聚合酶鏈式反應（QuantitativePolymeraseChainReaction）法，在支原體檢測中的應用主要體現在以下幾個方面：

1. 快速定性檢測：qPCR法可以快速檢測生產原料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液、治*用細胞中潛在的支原體污染。
2. 臨床樣本檢測：qPCR法可用于檢測實驗室樣本及臨床樣本中的支原體，具有快速、特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
3. 監(jiān)管要求：基于TaqMan的qPCR測定專門針對檢測細胞治*和復雜生物生產樣本中的支原體而開發(fā)，其性能滿足或超出監(jiān)管要求，如10CFU/mL。
4. 藥物質量控制：qPCR法提供早期檢測支原體污染的方法，適用于藥物質量控制，具有快速、高度特異性、靈敏性，并符合國際準則。
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細胞培養(yǎng)過程中支原體污染怎么預防？廣州細胞支原體檢測方法等溫擴增

LAMP法，即環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification），是一種在恒定溫度下進行的核酸擴增方法。它由日本學者Notomi于2000年開發(fā)。LAMP法檢測有以下特性：
快速高效：LAMP技術可以在1小時內把幾拷貝的目的序列迅速擴增到10^9^～10^10^拷貝，擴增效率高。
簡便性：LAMP技術不需要進行模板的預變性，減少了PCR技術升降溫帶來的影響以及對昂貴、精密實驗儀器的要求，同時擴增效率高，可以在較短時間內完成檢測。
LAMP法因其快速、高效、特異、靈敏和經濟等優(yōu)點，已經應用于病原菌、寄生蟲、病毒、疾病和轉基因產品檢測等領域，并且還將廣泛應用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食源安全等領域，具有更為廣闊的發(fā)展應用前景。
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