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上海anti Flag免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

來源： 發布時間：2024-07-31

免疫沉淀技術（Immunoprecipitation，簡稱IP）是一種生物學實驗方法，用于從細胞或組織裂解物中分離和純化特定蛋白質。這項技術依賴于抗體的高度特異性，通過抗體與目標蛋白質的結合，實現對目標蛋白質的富集和純化。
具體操作步驟通常包括以下幾個階段：裂解細胞或組織，抗體與蛋白質結合，固相支持物的使用，免疫復合物的捕獲，洗滌，洗脫分析。
免疫沉淀技術不僅可以用于檢測蛋白質的存在和量，還可以用于研究蛋白質的翻譯后修飾、蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質穩定性以及蛋白質的功能等。此外，免疫沉淀技術是許多其他高級實驗技術的基礎，如染色質免疫沉淀測序（ChIP-Seq）和蛋白質相互作用網絡分析等。
免疫沉淀技術Co-IP的實驗設計。上海anti Flag免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

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免疫沉淀純化所得抗原量低有多種原因，
A. 純化所得抗原量低
1. 抗原結合水平低
IP 應用中出現低抗原結合水平的可能原因有很多，結合反應所使用的溶液是重要原因之一。必須使用適合的緩沖液，有特定的pH和鹽濃度，可能還需要添加互作所需的輔助因子。IP 或Co-IP 中用于純化的抗體是影響得率的另一個重要因素。如果抗體本身易失活或與抗原結合微弱，則可能很難找到足夠溫和的條件，即能產生結合，又能保證在孵育和洗滌過程中結合可以穩定保持。
2. 抗原洗脫水平低
在某些情況下，抗原與抗體或結合蛋白結合之間可能會發生極強的相互作用，傳統的洗脫緩沖液無法將其破壞。如果需要使用溫和洗脫緩沖液收集功能性抗原，則上述矛盾尤為突出。

上海ChIP免疫沉淀磁珠原理免疫沉淀技術RIP的應用有哪些？

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免疫沉淀技術（Immunoprecipitation, IP）的實驗設計通常包括以下幾個關鍵步驟：

1. 目標蛋白質的選擇：
2. 抗體的選擇：選擇特異性強、親和力高的抗體來捕獲目標蛋白質
3. 樣本的準備：收集和準備細胞或組織樣本。
4. 蛋白質的裂解和釋放：選擇合適的裂解條件，如pH值、離子強度、去污劑等。
5. 蛋白質濃度的測定：確定裂解液中蛋白質的濃度，以便于后續步驟的標準化。
6. 免疫沉淀的操作：將特異性抗體與裂解液混合，并在適宜的條件下孵育，以形成抗體-抗原復合物。
7. 非特異性結合的減少：通過預純化步驟去除可能的非特異性結合蛋白。
8. 洗滌：多次洗滌以去除未結合的蛋白質和雜質。
9. 目標蛋白質的洗脫：使用適當的緩沖液洗脫抗體-抗原復合物。
10. 后續分析：對洗脫的蛋白質進行進一步分析，如Western Blot.
11. 對照實驗：設計適當的正對照和負對照，以評估實驗的特異性和敏感性。

免疫沉淀技術（Immunoprecipitation, IP）是一種利用抗體與特定蛋白質結合的特性，從復雜樣本中分離和純化目標蛋白質的實驗方法。這項技術在生物醫學研究中有著廣泛的應用場景，以下是一些主要的應用領域：
1. 蛋白質相互作用分析：通過免疫沉淀技術，研究人員可以研究蛋白質之間的相互作用，揭示蛋白質復合物的組成以及它們在細胞內的功能和調控機制。
2. 抗體藥物開發：免疫沉淀技術可以用于研究抗體藥物與其靶標蛋白的結合特性，評估抗體藥物的親和力和特異性，指導抗體藥物的設計和優化。
3. 蛋白質表達水平分析：通過比較不同條件下的免疫沉淀結果，可以評估目標蛋白的相對量，進而研究蛋白質的表達調控。
4. 染色質免疫沉淀（ChIP）：這是一種特殊的免疫沉淀技術，用于研究蛋白質與DNA的相互作用，如轉錄因子或組蛋白修飾與基因組特定區域的結合情況。
5. RNA免疫沉淀（RIP）：類似于ChIP，RIP用于研究RNA結合蛋白與RNA分子之間的相互作用。
免疫沉淀技術ChIP的原理是什么？

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“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結合蛋白，進行小規模的蛋白質親和純化的實驗。更確切地說，IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體，從復雜的混合物中，純化單一抗原的實驗。固定化蛋白質復合物的組裝既可以分步進行，也可以一步完成。

常見的加樣順序：抗體和樣本(如細胞裂解物)一起孵育，然后加入親和微珠，用于捕獲抗體-抗原復合物。也可以將抗體和微珠(通過抗體結合蛋白，如蛋白A、G或A/G等，直接或間接結合抗體)先進行孵育，然后再加入含有抗原的樣本。當抗原、抗體和固相支持物產生結合以后，充分洗滌微珠，再采用適當的洗脫緩沖液從支持物上洗脫抗原。
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RIP實驗步驟通常包括：
1. 細胞收集與交聯：培養細胞至適當密度。使用交聯劑（如甲醛）進行交聯，以固定蛋白質-RNA復合物。
2. 細胞裂解：收集細胞并進行裂解，釋放RNA-蛋白質復合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細胞，獲得更小的染色質片段，這有助于后續步驟中抗體的接觸。
4. 除去細胞碎片：通過離心去除細胞碎片和未裂解的細胞，收集含RNA-蛋白質復合物的上清液。
5. 免疫沉淀：將針對特定RNA結合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時間，使抗體與目標蛋白充分結合。
6. 捕獲免疫復合物：添加蛋白A或蛋白G結合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質-RNA復合物與珠子結合。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結合的蛋白質和RNA。
8. 洗脫與逆轉交聯：使用適當的緩沖液洗脫免疫復合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉交聯，釋放RNA。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進行純化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以確定與目標蛋白相互作用的RNA種類。
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